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    化学毕业论文 时间:2018-08-27 我要投稿

    双色球开奖号码 www.nsjl.net   摘要:目的:检测原工艺、发酵离心工艺、发酵醇沉工艺制备的消栓口服液中主要成分的含量变化。方法:采用HPLC法,以色谱峰面积为指标,比较不同制备工艺消栓口服液中黄芪甲苷、芍药苷、阿魏酸的含量变化。结果:发酵后黄芪甲苷的含量比原工艺组增加,而芍药苷和阿魏酸的含量减少。结论:不同工艺制备的消栓口服液主要化学成分的含量有所不同,微生物发酵技术可以为中药的开发利用提供新的思路。

      关键词:消栓口服液;发酵;含量测定

      消栓口服液为临床常用中药,它是在补阳还五汤的基础上研制的新剂型,具有补气活血、通络化瘀等功效。主治气虚血瘀引起的后遗症之半身不遂,口眼歪斜,言语不清,口角流涎,小便频数,下肢痿废,苔白脉缓以及脉络阻滞之疑难杂症[1]。消栓口服液是由黄芪、赤芍、川芎、当归、地龙、桃仁、红花7味药组成。方中重用黄芪补气,与活血化瘀药配伍,具有益气活血的功效,用以治疗气虚血瘀型中风[2],具有良好的临床效果[3]。发酵是传统中药加工炮制的重要方法之一[4],发酵中药借助微生物的作用,改变了中药原有药性,其主要特点就是发生了生物转化[5]。因此将微生物发酵技术引入中药,也就是将药材与辅料拌和,在一定温度和湿度下,通过微生物发酵可以达到提高药效、节约资源、降低毒副作用等目的[6]。目前,中草药发酵的研究已从单味药涉及到复方研究,并取得了显著成果[7]。本文对不同工艺制备的消栓口服液中3种主要成分进行含量测定,为消栓口服液的临床用药以及发酵中药的发展提供科学依据。

      1仪器与试药

      1.1仪器

      Agilent1200series高效液相色谱仪,AlltechSD2000蒸发光散射检测器(美国安捷伦)等。

      1.2试药与试剂

      黄芪甲苷对照品(批号:110781-200613)、芍药苷对照品(批号:110736-200526)、阿魏酸对照品(批号:110773-200611),均购于中国药品生物制品鉴定所;消栓口服液、发酵离心工艺消栓口服液、发酵醇沉工艺消栓口服液,均由济南三株集团医药生物研究所提供;甲醇、乙腈为色谱纯;磷酸、醋酸等试剂均为国产分析纯;哇哈哈纯净水等。

      2含量测定的方法与结果

      2.1样品溶液的制备

      2.1.1消栓口服液原工艺样品的制备分别精密称取黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花7味药,加水煎煮2次,第1次1.5h,第2次为1h,合并煎液。滤过,滤液减压浓缩至相对密度为1.18~1.22(50℃),加乙醇使含醇量为75%,静置,取上清液,回收乙醇,浓缩药液至120mL[8],加蔗糖54g,加热溶解,放冷,滤过,加苯甲酸钠0.9g,加水稀释至300mL,混匀,灌封,灭菌,即得[9]。2.1.2消栓口服液发酵后离心样品的制备分别精密称取上述7味药,同法煎煮,合并煎液。滤过,滤液减压浓缩至合适体积,配料,调pH,灭菌,接种噬酸乳杆菌、植物乳杆菌、短双歧杆菌,37℃培养24h,稳定化处理,离心,定容至750mL,分装,灭菌,即得。2.1.3消栓口服液发酵后醇沉样品的制备分别精密称取上述7味药,同法煎煮,合并煎液。滤过,滤液减压浓缩至合适体积,配料,调pH,灭菌,接种噬酸乳杆菌、植物乳杆菌、短双歧杆菌,37℃培养24h,减压浓缩至相对密度为1.18~1.22(50℃),加乙醇使含醇量为75%,静置,取上清液,回收乙醇,浓缩药液至适量,加蔗糖0.09g,溶解,放冷,滤过,加苯甲酸钠0.9g,加水稀释至300mL,混匀,分装,灭菌,即得。

      2.2对照品溶液的制备

      2.2.1黄芪甲苷对照品溶液的制备取五氧化二磷减压干燥24h的黄芪甲苷对照品适量,精密称定。加甲醇制成每1mL含0.6260mg的对照品溶液[10]。2.2.2芍药苷对照品溶液的制备取五氧化二磷减压干燥36h的芍药苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL含芍药苷0.232mg的对照品溶液。2.2.3阿魏酸对照品溶液的制备取五氧化二磷减压干燥24h的阿魏酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1mL溶液含阿魏酸0.108mg的对照品溶液。

      2.3供试品溶液的制备

      2.3.1黄芪甲苷供试品溶液的制备精密量取3种工艺消栓口服液各20mL,用水饱和正丁醇振摇提取4次,每次20mL,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤3次,每次30mL,弃去氨试液,正丁醇液蒸干,残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为测定黄芪甲苷的供试品[11]。2.3.2芍药苷供试品溶液的配置精密量取3种工艺消栓口服液各2mL,蒸干,加甲醇定容至25mL,超声30min,放至常温,补足损失甲醇,取续滤液,0.45μm滤膜滤过,作为测定芍药苷的供试品[12]。2.3.3阿魏酸供试品溶液的配置精密量取3种工艺消栓口服液各25mL,加甲醇75mL,超声20min,蒸干,用甲醇溶解,定容到10mL,过0.45μm滤膜,作为测定阿魏酸的供试品[13]。

      2.4黄芪甲苷的含量测定

      2.4.1色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm,5μm),乙腈-水(32∶68)为流动相,流速:1mLmin-1,蒸发光散射检测器,漂移管温度105℃,气体流量3.0Lmin-1,柱温25℃[14]。2.4.2线性关系考察精密量取黄芪甲苷对照品溶液,分别将5、10、15、20、25μL注入液相色谱仪中,按照“2.4.1”项下色谱条件测定峰面积积分值。以黄芪甲苷的峰面积对数(Y)为纵坐标,以进样量的对数(X)为横坐标,进行线性回归,求得回归方程为Y=1.4303X+2.1451,R=0.9992,结果表明,黄芪甲苷在3.13~15.65μg进样量的对数与峰面积的对数呈良好的线性关系。2.4.3方法学考察(1)精密度试验:吸取上述对照品溶液适量,按照上述色谱条件测定,连续进样6次,测得黄芪甲苷峰面积,经计算其RSD=1.63%(n=6),表明精密度良好。(2)稳定性试验:取消栓口服液的样品供试液,按照上述色谱条件分别于0、2、4、8、12、24h测定,结果黄芪甲苷RSD=1.53%(n=6)。表明供试品在24h内稳定性良好。(3)重复性试验:取同一批原工艺消栓口服液,按上述方法平行制备6份并测定黄芪甲苷含量,结果平均含量为0.1844mgmL-1,RSD=1.75%。(4)加样回收试验:取已测知黄芪甲苷含量(0.1844mgmL-1)的消栓口服液8mL,分别加黄芪甲苷对照品2.4mL(相当于黄芪甲苷1.5024mg),按“2.3”项下方法制备供试品溶液,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,分别精密吸取对照品溶液5、10μL,供试品溶液10μL,注入液相色谱仪中,测定黄芪甲苷峰面积积分值,计算黄芪甲苷平均回收率。结果显示,黄芪甲苷的平均加样回收率为99.27%,RSD为1.46%。2.4.4含量测定分别取不同工艺消栓口服液各3批,按上述方法制备供试液并测定,每批连续进样3次,以外标两点法计算样品中黄芪甲苷含量。2.4.5高效液相色谱图见图1~图2。

      2.5芍药苷的含量测定

      2.5.1色谱条件色谱柱:依利特HypersilODS2(4.6mm×150mm,5μm),流动相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(20∶80),流速:1.0mLmin-1,柱温:25℃;检测波长:芍药苷230nm,进样量:20μL[15]。2.5.2线性关系的考察取芍药苷对照品溶液(0.2320mgmL-1),分别用甲醇配成0.2320、0.1160、0.0773、0.0464、0.0258mgmL-1的系列对照品溶液,取20μL注入液相色谱,用上述色谱条件测定,记录峰面积,以芍药苷对照品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程,Y=28329X-11.7483,R=0.9994,表明芍药苷在4.64~0.5165μg线性范围内峰面积与浓度的量呈良好线性关系。2.5.3方法学考察(1)精密度试验:取浓度为0.232mgmL-1的芍药苷对照品溶液,重复进样6次,测定其峰面积,结果RSD为1.35%,表明精密度良好。(2)稳定性试验:取同一供试品溶液,按“2.5.1”项下色谱条件,分别于0、2、4、6、8、16、24h进样测定,RSD=1.42%(n=6),表明在24h内测定结果稳定。(3)重复性试验:取同一供试品溶液,按照“2.3”项下方法平行制备6份,按照上述方法测定,RSD=1.60%,表明重复性较好。(4)加样回收试验:取原工艺消栓口服液2mL,加芍药苷对照品11.25mL(相当于芍药苷2.61mg),按照“2.3”项下方法制备供试品并测定,计算芍药苷平均回收率。结果,芍药苷的平均加样回收率为99.65%,RSD为1.81%。2.5.4含量测定取不同工艺消栓口服液各3批,按照“2.3”项下方法制备供试品并测定,分别精密吸取20μL,每批连续进样3次,测定峰面积,计算样品中芍药苷含2.5.5高效液相色谱图

      2.6阿魏酸的含量测定

      2.6.1色谱条件色谱柱:依利特HypersilODSC18柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-1%醋酸水溶液;流速:1.0mLmin-1;柱温:25℃;检测波长:阿魏酸320nm;进样量:20μL[16]。2.6.2线性关系的考察取阿魏酸对照品溶液(0.108mgmL-1),分别用甲醇配成0.036、0.0154、0.0098、0.0072、0.0057mgmL-1的系列对照品溶液,按“2.6.1”项下色谱条件进样,每次进样20μL,记录峰面积。以峰面积为纵坐标,对照品浓度为横坐标,绘制标准曲线,求得回归方程为:Y=94920X-81.2,R=0.9995。结果表明阿魏酸在0.114~0.72μg范围内呈良好线性关系。2.6.3方法学考察(1)精密度试验:取浓度为0.108mgmL-1的阿魏酸对照品溶液,每次进样量20μL,重复进样6次,测定其峰面积积分值,经计算其相对标准偏差RSD的值为1.17%。(2)稳定性试验:取原工艺消栓服液适量,按照“2.3”项下方法制备,分别于0、2、4、8、12、24h进样测定,每次进样量20μL,测定阿魏酸峰面积积分值,其相对标准偏差RSD值为1.22%(n=6)。结果表明,供试品在24h内稳定性良好。(3)重复性试验:取同一批原工艺消栓口服液,按照“2.3”项下方法平行制备6份,注入液相色谱仪,每次进样20μL,测定阿魏酸峰面积积分值。阿魏酸的平均含量为0.0112mgmL-1,RSD为1.30%,结果表明重复性良好。(4)加样回收试验:取原工艺消栓口服液10mL,加阿魏酸对照品1mL(相当于阿魏酸0.108mg),按“2.3”项下方法制备供试品并测定,计算回收率,平均回收率为99.23%,RSD为1.57。2.6.4含量测定取3批原工艺消栓口服液,按照“2.3”项方法制备供试品并测定,计算样品中阿魏酸含量。2.6.5高效液相色谱图见图5~图6。2.7结果从表1可以看出,黄芪甲苷的含量发酵前后比较是原工艺组最低,发酵离心组和发酵醇沉组都有些增高,而芍药苷和阿魏酸正好相反,由于在消栓口服液中主要有效成分是黄芪甲苷,所以说可以进行适量发酵。

      3讨论

      本文对不同制备工艺的消栓口服液中的黄芪甲苷、芍药苷、阿魏酸的含量进行了测定。含量测定方法参考有关权威文献,采用高效液相色谱法,通过对流动相的选择、检测波长的确定、线性范围、精密度、回收率等研究确定了最佳的检测条件。结果显示黄芪甲苷经发酵后含量稍高于原工艺组,说明发酵后可能有些成分转换为黄芪甲苷[17],相反芍药苷和阿魏酸经发酵后的含量低于原工艺组,可能芍药苷和阿魏酸经过发酵后会分解或转换[18],因此黄芪甲苷、芍药苷和阿魏酸等主要成分的含量变化有待进一步研究。本文将发酵技术应用于中药复方制剂的制备工艺,提高了中药复方制剂的质控标准,从而保证了药物的临床疗效[19]。该研究也为中药开发研究提供了新的思路,具有很好的社会和经济效益,为今后发酵中药的临床应用提供科学依据并奠定坚实的基础[20]。

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